default_top_notch
default_news_top
default_news_ad1
default_nd_ad1

배양액 교체만 세포시트 회수 성공

기사승인 2020.03.11  19:37:27

공유
default_news_ad2

배양액 교체만 손상 없이 세포시트 회수에 성공

표피의 두께 증가하여 상처가 빠르게 치유

온도․산성도 변화 없이 생리학적 조건에서 단시간내 시트형상 회수

피부나 연골 등 조직손상이 심한 부위에 생체이식을 하려면 체외에서 해당 세포를 배양하여 증식시키는 과정이 필요하다. 이 때 평면형태의 기판 위에 시트 형태로 단단히 접착되어 자라는 세포시트를 손상 없이 떼어내는 것이 중요하다. 건강한 세포를 분리하여 손상조직에 이식할 충분한 양으로 증폭시킨 후, 시트(sheet) 형상으로 회수할 수 있는 세포배양 플랫폼이 개발되었다.

KAIST 생명화학공학과 임성갑 교수와 연세대학교 생명공학과 조승우 교수연구팀이 온도변화 없이 단시간 내 세포 시트를 배양기판으로부터 손상없이 분리하는 방법을 개발했다고 한국연구재단은 밝혔다.

배양조건 그대로 배양액(buffer)만 교체, 세포수확 과정에서의 손상을 줄여 이식 후 손상조직의 재생효율을 높일 단초가 될 것으로 기대된다. 백지응 박사, 박현지 박사, 조영학 박사과정 학생이 제1저자로 참여한 이번 연구의 성과는 국제학술지‘어드밴스드 머티리얼스’지에 3월 11일 게재 되었다.

기존에는 배양온도를 세포에 적합한 37oC에서 20oC 이하로 낮춰 20분 이상 노출, 기판을 친수성으로 바꿔 세포시트를 분리하는 방식 등이 시도되었다. 하지만 세포에 스트레스가 되는 급격한 온도저하와 소요시간으로 인해 세포시트의 손상이 우려되었다.

이에 연구팀은 배양기판 표면을 생체적합성 고분자로 코팅, 세포와 배양기판 간의 접착력을 정밀히 조절할 수 있도록 표면을 개질하였다. 이를 통해 세포가 자라는 데 필요한 영양분이 든 배양액을 교체하는 간단한 방법으로 온도나 산성도 변화 없이 100초 내에 배양하던 세포를 시트형상으로 회수하는 데 성공했다.

세포와 세포, 그리고 세포와 세포외기질 간의 부착에 중요한 역할을 하는 세포막 단백질인 인테그린과 배양기판 표면 사이의 접착이 양이온에 의존한다는 점에 착안하여 양이온이 없는 배양액을 처리, 세포시트를 신속하게 분리할 수 있었다.

실제 인간성체줄기세포, 쥐근아세포, 인간피부섬유모세포 등 여러 세포를 파종(seeding)하여 배양한 후, 배양환경 그대로 시트형태로 수확해 냈다. 이렇게 얻은 세포의 세포주기와 DNA 함량은 정상 범위였으며, 특히 줄기세포시트의 경우 재생효과물질의 분비가 2배 이상 증가했다.

나아가 수확한 세포시트를 적층, 당뇨병성 궤양 생쥐모델에 이식하자 상처부위 면적이 급격히 감소하고 표피의 두께가 증가하는 등 상처가 빠르게 치유되었다. 허혈성 생쥐모델에 이중층 세포시트를 이식하자 혈관형성 촉진과 혈류 흐름 증가가 나타났으며 피부궤사와 허혈성 사지 손실이 완화되었다.

교신저자인 KAIST 이은정 연구교수는“개발한 세포시트 수확방법을 토대로 향후 심근세포, 위장세포, 각막세포 등 여러 조직의 세포시트를 활용한 조직재생 연구를 수행할 계획”이라고 밝혔다.

이번 연구는 과학기술정보통신부와 한국연구재단이 추진하는 기초연구 사업 (중견연구) 및 선도연구센터지원사업 등의 지원으로 수행되었다.

논문명은 A Surface-Tailoring Method for Rapid Non-thermosensitive Cell Sheet Engineering via Functional Polymer Coatings이며 저자는 백지응(제1저자/한국과학기술원), 조영학(제1저자/한국과학기술원), 박현지 박사(제1저자/연세대학교), 최고로(한국과학기술원), 이종승(연세대학교), 이민석 (한국과학기술원), 유승정(한국과학기술원), 조승우 교수(교신저자/연세대학교), 이은정 교수(교신저자/한국과학기술원), 임성갑 교수(교신저자/한국과학기술원)

□연구의 주요내용

1. 연구의 필요성

○ 피부나 연골, 신경, 심근 등의 생체조직이 크게 손상되면 해당 조직의 이식을 통해 치료할 수 있다. 하지만 이식 가능한 조직은 지극히 한정적이어서 조직의 복원, 재생을 위해서는 환자의 세포로부터 생체 이식이 가능한 조직으로 재생시키는 기술이 필요하다.

○ 통상 2차원적으로 배양된 세포를 트립신과 같은 단백질 분해효소를 사용 하여 단일세포 형태로 얻는데 이 과정에서 세포외기질을 비롯해 세포 표면의 수용체(receptor)가 손상될 수 있어 세포기능 저하로 이어질 수 있다. 세포를 이식한 후 재생효율이 낮아지는 원인 가운데 하나이다.

※ 세포외기질(extracellular matrix; ECM) : 동물의 구조적 지지 등을 담당하는 조직으로, 세포형태를 유지할 수 있게 구조적인 기반이 되어주고, 조직 구성의 틀이 되며, 마지막으로 세포 사이 신호를 주고 받는데 도움을 준다.

○ 때문에 분해효소를 이용하는 대신 단일세포가 아닌 시트(sheet) 형상 으로 세포를 회수하여 이식하면 세포와 세포외기질 등이 온전한 채로 이식할 수 있다.

○ 이를 위해 기존에는 온도 감응형 고분자 박막 위에 세포를 배양한 후, 온도를 20도씨 이하로 낮춰 배양 기판을 소수성에서 친수성으로 전환, 세포를 기판으로부터 분리해 냈다.

○ 하지만 이 방식은 저온과정에서 세포 손상이 유발되며, 수용성 고분자 박막이 활용되어 배양용기의 제작이 대단히 까다로웠다.

2. 연구내용

○ 고분자를 배양기판에 코팅하여 표면자유에너지를 조절, 세포와 배양 기판 사이의 부착력을 제어할 수 있는 플랫폼 기술을 개발하였다.

○ 세포 부착력에 중요한 인테그린(integrin)과 배양 표면 사이의 접착은 양이온성 물질에 농도에 의존하기 때문에 양이온이 없는 버퍼로 처리하는 방식으로 기존의 방식에 비해 십분의 일 수준의 매우 빠른 시간 (100초 이내)에 온도변화 없이 세포시트를 회수할 수 있었다.

※ 인테그린(Integrin) : 세포-세포 외 매트릭스 접착을 돕는 막 관통 수용체. 리간드 결합시, 세포주기 조절, 세포 골격 구성, 및 세포막에 대한 새로운 수용체의 이동과 같은 세포 신호를 매개하는 신호 전달 경로를 활성화시킨다.

※ 버퍼(buffer) : 모든 세포 배양 배지에는 이러한 대사산물로 인해 발생되는 pH의 변화를 줄이기 위해서 완충 작용을 하는 물질

○ 기존 방식에 비해 세포회수 시간이 상당히 단축되고, 온도 및 pH가 생체 내 조건과 동일하여 세포의 손상을 최소화 할 수 있다.

○ 실제 당뇨성 궤양 쥐모델에 이렇게 회수된 이중층 세포시트, NHDF (normal human dermal fibroblasts)-hMSC(human mesenchymal stem cells)를 이식하자 표피세포 성장 및 콜라겐 분비가 증가, 상처가 빠르게 치유됨을 확인하였다.

○ 또한 허혈성 쥐모델에 이중층 세포시트, C2C12(mouse myoblasts)-hMSC (human mesenchymal stem cells)를 이식, 혈관형성 촉진과 혈류흐름 증가를 통해 피부궤사와 허혈성 사지 손실을 효과적으로 막는 것을 확인하였다.

3. 연구성과/기대효과

○ 세포에 무리가 될 수 있는 온도변화 과정을 생략하고 트립신 효소 또는 EDTA와 같은 세포에 독성이 있는 물질들을 사용하지 않아 세포주기와 DNA 손실 없이 높은 효율로 세포시트를 회수할 수 있는 실마리를 제공하였다.

○ 손상조직의 재생을 유도할 정도의 충분한 양으로 세포를 배양하여 시트 형태로 손상 없이 회수, 3차원으로 적층할 수 있는 플랫폼을 제시함으로 써 향후 세포 이식 후 손상된 조직의 재생효율을 높이는 데 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

○ 특히 세포치료제 측면에서 범용성 및 확장성이 있어 환자의 자가세포를 활용 한다면 자가이식 효과를 높이는 실마리가 될 것으로 기대된다.

 

□그림 설명

그림 1. 온도변화 과정이 필요 없는 세포시트 제작 개요도

iCVD 고분자 공중합체 분율 조절을 통해 표면 자유에너지를 제어, 세포-표면의 부착력을 제어하고 2가 양이온 농도 조절을 통해 세포시트 탈착이 유도되도록 하였다.

(제공 : KAIST 임성갑)

 

그림 2. 고분자 표면에서 비온도 감응형으로 제작된 세포시트 회수효율

a) 고분자가 코팅된 표면(노란색)에서만 세포 시트가 형성되는 것을 확인

b) 다양한 종류의 세포주로부터 세포시트가 형성되는 것을 확인

c) 세포 시트 분리 전/후 세포외기질 및 세포-세포 접합 부위의 염색 이미지 F-actin (적색), N-cadherin (녹색) 및 Fibronectin (분홍색)

d) 세포 시트 분리 전/후 세포의 Live/dead 이미지,

(제공 : KAIST 임성갑)

그림 3. 당뇨성 허혈 생쥐모델에의 세포시트 이식 효과 검증

비온도감응형 pDV 표면과 기존의 온도감응형 pNIPAm 표면에서 각각 제작된 세포 시트를 당뇨성 허혈 모델에 이식 21일 후 치료 효과를 검증하였다

(a, c) 다리 재생 능력 비교 사진 및 정량 분석 : pDV-세포시트를 이식한 그룹에서만 완전히 회복되어 허혈성 다리손실이 없음을 증명.

(b, d) 혈류량 분석을 통한 혈관 재생 능력 치료 효과 비교 및 정량 분석 : pDV-세포시트를 이식한 그룹에서 허혈성 조직으로의 혈액공급이 증가되고 있음을 증명.

(제공 : 연세대학교 조승우)

그림 4. KAIST 연구진 사진(제공 : KAIST 임성갑)

왼쪽부터 유승정 박사, 이은정 연구교수 (교신저자), 임성갑 교수 (교신저자), 조영학 (제1저자), 백지응 박사(제1저자),

 

그림 5. 연세대학교 연구진 사진(제공 : 연세대학교 조승우)

왼쪽부터 조승우 교수 (교신저자), 박현지 박사 (제1저자), 이종승

 

□연구자 소개

<임성갑 교수, 교신저자>

1. 인적사항

○ 소 속 : KAIST 생명화학공학과

2. 학력

○ 1997 : 서울대학교 (학사 : 화학공학과)

○ 1999 : 서울대학교 (석사 : 화학과학과)

○ 2009 : MIT (박사 : 화학공학과)

3. 경력사항

○ 1999 – 2002 : LG화학 기술연구원

○ 2002 – 2004 : LG Display 연구소

○ 2009 – 2010 : MIT 화학공학과/Harvard Medical school, 박사후 과정

○ 2010 – 현재 : KAIST 교수

4. 전문분야 정보

○ 기능성 고분자 박막, 표면 개질, 생체재료, 기상증착(CVD) 공정

5. 연구지원 정보

○ 2017~2020 과학기술정보통신부‧한국연구재단 기초연구사업(중견연구)

○ 2016~2021 과학기술정보통신부‧한국연구재단 기초연구사업(웨어러블플랫폼소재기술센터)

 

<조승우 교수, 교신저자>

1. 인적사항

○ 소 속 : 연세대학교 생명공학과

2. 학력

○ 1999 : 서울대학교 (학사: 응용화학부)

○ 2001 : 서울대학교 (석사: 응용화학부)

○ 2006 : 서울대학교 (박사: 응용화학부)

3. 경력사항

○ 2007 – 2009 : MIT 화학공학과, 박사후 연구원

○ 2010 – 2013 : 연세대학교 생명공학과 조교수

○ 2013 – 2018 : 연세대학교 생명공학과 부교수

○ 2017 – 현재 : IBS 나노의학연구단 연구위원

○ 2018 – 현재 : 연세대학교 생명공학과 교수

○ 2020 – 현재 : 연세대학교 생명시스템대학 부학장

4. 전문분야 정보

○ 줄기세포, 조직공학, 약물전달 및 기능성 생체재료 연구

5. 연구지원 정보

○ 2017 ~ 2020 과학기술정보통신부‧한국연구재단 기초연구사업(중견연구)

한국연구재단 홍보실 제공

 

노벨사이언스 webmaster@scinews.kr

<저작권자 © 노벨사이언스 무단전재 및 재배포금지>
default_news_ad5
default_side_ad1
default_nd_ad2
default_side_ad2

Reseach

1 2 3 4 5
item59
default_side_ad3

섹션별 인기기사 및 최근기사

default_side_ad4
default_nd_ad6
default_news_bottom
default_nd_ad4
default_bottom
#top
default_bottom_notch